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HPLC e GC: un confronto tra le tecniche

HPLC

Molti composti chimici possono essere analizzati mediante gascromatografia (Gas Chromatography – GC) o cromatografia liquida ad alte prestazioni (High Performance Liquid Chromatography – HPLC).

La gascromatografia, applicata alla determinazione di sostanze volatili, trova ampia applicazione nell’industria petrolifera e petrolchimica, nell’industria alimentare e cosmetica per la determinazione negli aromi e nelle fragranze, nel settore farmaceutico/chimico per la determinazione di impurezze volatili nei prodotti finiti o nelle materie prime e nel settore ambientale per il monitoraggio della qualità dell’aria.

Per quanto riguarda la cromatografia liquida, nell’ambito della biologia e della medicina, l’HPLC viene spesso utilizzato per analizzare campioni biologici e ambientali per verificare la presenza o l’assenza di composti noti (ad esempio metaboliti, farmaci, tossine, pesticidi) e può aiutare nell’identificazione di composti sconosciuti.

Nell’ambito chimico e farmaceutico, tuttavia, l’HPLC viene regolarmente utilizzato per monitorare le reazioni chimiche e per determinare la purezza dei prodotti. Inoltre, il processo di HPLC può essere modificato in HPLC preparativo, permettendo la purificazione di un composto per un ulteriore analisi o uso.

Poiché entrambe le tecniche cromatografiche funzionano secondo gli stessi principi di base di separazione, identificazione e quantificazione dei composti, a volte può essere difficile scegliere l’uno rispetto all’altro.

Ma sapere cosa differenzia HPLC e GC può sicuramente aiutare nella scelta dello strumento giusto per l’analisi.

Evidenziamo di seguito alcune differenze fondamentali relative alle due tecniche cromatografiche:

La natura dei campioni

Il GC come detto in precedenza, risponde alle sostanze che possono sperimentare un cambiamento di stato alla fase gassosa con il calore, ovvero composti volatili. Pertanto, il GC è limitato all’analisi di composti a basso peso molecolare e stabili alle alte temperature. Se stai quindi lavorando con composti di natura proteica, dimenticalo, purtroppo il GC non fa per te.

L’HPLC invece dà la possibile di analizzare composti volatili e non volatili, da pesi molecolari bassi a elevati, purché siano solubili in una fase liquida. Inoltre, non è necessario preoccuparsi della stabilità termica poiché i campioni di solito vengono analizzati a temperatura ambiente.

Sicuramente, l’amplia applicazione analitica offerta dall’HPLC è una delle sue caratteristiche più interessanti.

Ma se entrambe le tecniche sono ancora applicabili per l’analisi del tuo campione, non prendere ancora una decisione perché c’è altro da considerare.

La Fase mobile

Come implicito dai loro nomi, la fase mobile per l’analisi HPLC è liquida e per l’analisi GC è un gas. Un’altra grande differenza è che la fase mobile è un partecipante chiave nella separazione dei campioni durante un’analisi HPLC, ma non per un’analisi GC.

Per l’analisi HPLC si utilizzano miscele di solventi che permettono l’eluizione di composti attraverso la colonna lungo un gradiente di concentrazione. La polarità, la solubilità e la complessità del campione sono alcuni dei fattori che influenzano la selezione della fase mobile. Per essere chiari, la scelta della fase mobile è una parte cruciale nell’esecuzione di un’analisi HPLC e la risoluzione dei problemi per una migliore separazione è spesso complessa.

Al contrario, per il GC si utilizza come fase mobile un gas inerte puro, comunemente noto come gas vettore perché il suo scopo è trasportare le molecole attraverso la colonna cromatografica. Alcuni esempi sono elio, azoto e argon e in genere, il gas di trasporto utilizzato viene scelto in base al rivelatore presente nello strumento.

La Colonna o Fase stazionaria

Le colonne HPLC sono corte, larghe e la fase stazionaria è comunemente realizzata con resine a base di silice, ma possono essere composte da una varietà di sostanze. Lunghe catene di carbonio apolari, funzionalizzano le particelle di silice. Più lunga è la catena, più apolare è la colonna. Le più utilizzate sono colonne contenenti catene a 18 atomi di carbonio, note come colonne C18.

Al contrario, la colonna GC è un tubo molto sottile a spirale, realizzato in materiale metallico o di vetro che può resistere a temperature elevate e può variare in lunghezza o diametro. All’interno del tubo si trova la fase stazionaria che può essere costituita da un diverso numero di materiali, con polarità variabili e comunemente possono essere di due tipi: colonne impaccate (la fase stazionaria viene assemblata come materiale compattato) e colonne capillari (la fase stazionaria viene assemblata come film di rivestimento murale).

Le colonne capillari presentano molti vantaggi rispetto alle colonne impaccate, tra cui una migliore separazione e una maggiore velocità di passaggio. Per questo motivo, la GC capillare è generalmente preferita all’HPLC (quando possibile) per l’analisi di campioni altamente complessi.

Il rivelatore

I rivelatori rispondono alle proprietà chimiche o fisiche di una molecola . Alcuni sono universali – possono rilevare tutti (o la maggior parte) dei composti – e altri sono selettivi rispondendo a una proprietà specifica.

I rivelatori GC variano in selettività e sensibilità. Il rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) e il rivelatore a conducibilità termica (TCD) sono due esempi comuni. Il primo è selettivo per gli idrocarburi, mentre il secondo è universale.

Se il tuo laboratorio ha un HPLC, è probabile sia costituito da un rivelatore spettroscopico a raggi UV/Vis, che risponde a molecole che assorbono la luce come per esempio i composti aromatici. Comunemente usato è anche il rivelatore a indice di rifrazione (RID) perché ha capacità di rilevamento universali, ma tuttavia, soffre di bassa sensibilità.

Il rilevatore è applicato alla fine della colonna permettendo un’analisi in continuo dell’eluito. Si ottiene un cromatogramma, il grafico che rappresenta la quantità di sostanza rilevata in funzione del tempo; da quest’ultimo è possibile identificare e/o quantificare le sostanze iniettate.

Indubbiamente, il metodo di rilevamento più potente però è quello offerto da GC-MS e HPLC-MS (o LC-MS). Questi sistemi analitici combinano le caratteristiche del cromatografo con quelle di un rivelatore spettrometrico di massa (MS). In questo modo, uno strumento (HPLC/GC) separa i componenti e il secondo strumento (MS) fornisce una determinazione della massa per ciascuno di questi componenti e quindi ulteriori informazioni per l’identificazione delle singole sostanze.

La risoluzione

Se il campione è una miscela, bisogna tenere presente che la risoluzione – una misura della efficienza di una colonna cromatografica nella separazione di due analiti – è influenzata da una serie di fattori, che si può riassumere a quanto simile sia l’equilibrio di ripartizione tra la fase mobile e la fase stazionaria per i diversi composti. Più è paragonabile l’equilibrio di ripartizione tra due sostanze dello stesso campione, maggiori sono le possibilità di co-eluizione con quindi una scarsa separazione.

Poiché la separazione GC è basata sulla volatilità dei composti, pesi molecolari simili possono determinare tempi di ritenzione simili. Allo stesso modo, la polarità delle molecole influisce sulla scelta e composizione della fase mobile e di conseguenza sulla risoluzione dell’HPLC.

In conclusione, sia la gascromatografia e la cromatografia liquida ad alte prestazioni sono entrambe tecniche di separazione che riscuotono un enorme successo in qualsiasi laboratorio chimico, sia accademico, sia industriale; sono infatti un progresso inestimabile nella strumentazione analitica e indispensabili in molti campi scientifici.

Da non dimenticare però che fondamentale è la conoscenza approfondita del campione in analisi, il quale influenza profondamente la selettività, la sensibilità e la risoluzione dello strumento.

Krizia Ferrarese | Senior Consultant

 

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